П.Ф. Забродский, М.С. Громов, В.В. Масляков: Влияние активации α7n- ацетилхолинорецепторов и антител к фактору некроза опухоли-α на летальность мышей и концентрацию провоспалительных цитокинов в крови в ранней фазе сепсиса

Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ» В эксперименте на неинбредных белых мышах установлено, что активация a7n- ацетилхолинорецепторов анабазином (0.5 LD50) и применение антител к ФНО-α (1 мг/кг) за 2 ч до моделирования сепсиса существенно снижает летальность мышей от экспериментального сепсиса (внутрибрюшинное введение E. coli) вследствие уменьшения в крови концентрации провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6. При комбинированном применении антител к ФНО-α и анабазина наблюдался их аддитивный эффект. ______________________________________________________________

Ключевые слова: холинергический противовоспалительный путь, сепсис, α7n- ацетилхолинорецепторы, антитела к ФНО-α, провоспалительные цитокины

THE EFFECT OF ACTIVATION OF α7n-ACETYLCHOLINE RECEPTORS AND ANTI- TUMOR NECROSIS FACTOR-α ANTIBODY ON MORTALITY OF MICE AND CONCENTRATION PROINFLAMMATORY CYTOKINES IN BLOOD IN EARLY PHASE OF SEPSIS P.F. Zabrodskii, M.S. Gromov, V.V. Maslyakov Saratov Branch of Samara Medical Institute «REAVIZ» It was established in experiments on noninbred mice that the use anti-TNF-α antibody (1 mg / kg) and activation of α7nAChR of anabasine (0,5 LD50) for 2 hours before modeling sepsis caused significant reduction of mortality of mice from experimental sepsis ((intraperitoneal injection of E. coli) due to a reduction in blood of concentration of the proinflammatory cytokine TNF-α , IL-1β, IL-6 . Combined administration of anti-TNF-α antibody and anabasine lead to an additive effect. ______________________________________________________________

Keywords: cholinergic anti-inflammatory pathway, sepsis,, α7nAChR, anti-TNF-α antibody, proinflammatory cytokines Адрес для корреспонденции: pfzabrodsky@gmail.com Забродский П.Ф. В настоящее время смертность от сепсиса в зависимости от множества факторов составляет от 12 до 60% от всех смертельных исходов, связанных с болезнями и их осложнениями [12], причем этот показатель продолжает увеличиваться [7]. В 1987 году было установлено, что холинергическая стимуляция существенно снижает летальность белых мышей от сепсиса [1], а в последующем доказана целесообразность применения холиномиметиков для экстренной активации неспецифической антимикробной резистентности организма при различных инфекционных процессах [2]. Выявленный феномен обеспечивается реализацией холинергического антивоспалительного пути (механизма) - «cholinergic anti-inflammatory pathway» [2,3,9,14], который включает: активацию м-холинорецепторов (mAChR) головного мозга, модулирующих иммунорегуляторную функцию блуждаюшего нерва; возбуждение эфферентных волокон n. vagus; действие ацетилхолина на α7n-ацетилхолинорецепторы (α7nAChR) клеток макрофагально-моноцитарной системы (ММС). В клетках ММС возникновение антивоспалительного эффекта обеспечивается киназой JAK2; фактором транскрипции STAT3; транскрипционным фактором NF-κB. Под влиянием холинергической стимуляции реализация данных биохимических механизмов клетки ингибирует продукцию клетками ММС ФНО-α, протеина B1 - HMGB1, макрофагально- воспалительного протеина-2 - MIP-2, интерлейкинов - ИЛ-1β, ИЛ-6 [6]. Активация ацетилхолином α7nAChR макрофагов, моноцитов и нейтрофилов приводит к снижению летальности от сепсиса [1,2,10] вследствие уменьшения продукции этими клетками провоспалительных цитокинов (ПВЦ) [9]. Доказано, что такой же эффект способен вызвать м-холиномиметик ацеклидин, действующий на mAChR ядра n. vagus продолговатого мозга [3]. В настоящее время представляют интерес исследования, направленные на изучение возможности снижения летальности при сепсисе путем применения активаторов α7nAChR [3,11], а также антител к цитокину ФНО-α [4,8]. Целью исследования являлась оценка влияния активации α7nAChR и антител к ФНО-α, а также их комбинированного эффекта на летальность мышей в ранней фазе сепсиса, вызванного экспериментальным перитонитом, и содержание провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6 в крови.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на беспородных белых мышах обоего пола массой 18-22 г. Активацию α7nAChR проводили подкожным введением анабазина [15] (SigmaAldrich) (0,5 DL50) за 2 ч до моделирования сепсиса (DL50 анабазина составляла для мышей 10,6±1,2 мг/кг). Мышиные анти-ФНО-α моноклональные антитела (МАФНО) (клон MP6-XT22, R&D Systems, номер в каталоге MAВ4101), вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 1 мг/кг. Через 2 ч после применения препаратов, а также их комбинации, у мышей вызывали сепсис внутрибрюшинным введением 2,5·109 суточной культуры микробных тел E. coli [1,3,13]. В контрольную группу 1 входили мыши, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия соответственно подкожно (0,5 мл), а через 2 ч – внутрибрюшинно (2,0 мл). Регистрацию летальности мышей после моделирования септического процесса проводили через 4 и 24 ч без применения препаратов (контрольная группа 2; мыши за 2 ч до введения взвеси E. Coli получали подкожно по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия), с применением анабазина (группа 3), МАФНО (группа 4) и комбинации анабазина и МАФНО (группа 5). Концентрацию ПВЦ ФНО-α, ИЛ1β и ИЛ-6 исследовали в плазме крови всех групп мышей (группы 1, 2, 3, 4, 5) методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits MyBioSoure) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для определения концентрации ПВЦ применяли моноклональные антитела MyBioSoure (ФНО-α, ИЛ1β, ИЛ-6 - номера в каталоге соответственно MBS494184, MBS494492, MBS670075). Кровь для исследований забирали из ретроорбитального венозного синуса. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Применение анабазина, МАФНО, а также их комбинации за 2 ч до введения E. coli приводило к снижению (p<0,05) летальности через 4 ч по сравнению с контрольной группой 2 (сепсис) соответственно в 2,50; 1,88 (p>0,05) и 3,79 раза (p<0,05) (на 15,0; 11,7 и 18,4%), а через 24 ч – в 1,29; 1,59 и 2,46 раза (на 20,0; 33,4 и 53,4%) (p<0,05) соответственно (табл. 1). Таблица 1. Влияние анабазина (0,5 DL50), моноклональных антител к ФНО-α (МАФНО; 1 мг/кг) и их комбинированного действия на летальность мышей после моделирования сепсиса (М+m ) Серии опытов Срок исследования летальности после введения E. coli, ч 4 24 Сепсис (контрольная группа 2, n = 40) 25,0±6,8 90,0±4,7 Анабазин + сепсис (группа 3, n = 30) 10,0±4,8 70,0±8,4* МАФНО + сепсис (группа 4, n = 30) 13,3±6,2 56,6±9,2* Анабазин + МАФНО + сепсис (группа 5, n = 30 ) 6,6±4,5* 36,6±8,7** Примечание. * -p<0,05 по сравнению с контролем (группа 2);** -p<0,05 по сравнению с контролем и группами 3 и 4. Это свидетельствует о том, что активация α7nAChR и связывание (нейтрализация) МАФНО ФНО-α, существенно увеличивают выживаемость животных в ранней фазе сепсиса. При этом эффект анабазина существенно не отличается от действия МАФНО. Комбинированное действие активатора α7nAChR анабазина и МАФНО вызывало больший эффект, чем изолированное воздействие данных препаратов (p<0,05) (аддитивное действие). При сепсисе (контрольная группа 2) в крови существенно увеличивалось содержание ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 по сравнению с группой 1 (интактные животные), особенно выраженное через 4 ч после внутрибрюшинного введения взвеси E. coli (соответственно в 20,22 и 27,50 и 61,15 раза (p<0,05). Активация α7nAChR анабазином за 2 ч до моделирования сепсиса приводило через 4 ч после введения E. coli мышам (группа 3) к снижению концентрации в крови ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 в по сравнению показателями при сепсисе (контрольная группа 2) без применения препаратов соответственно в 3,18; 2,21 и 7,76 раза (p<0,05). При этом содержание ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 в крови достоверно (p<0,05) превышало показатели контрольной группы 1 (табл. 2). Таблица 2. Влияние анабазина (0,5 DL50), моноклональных антител к ФНО-α (МАФНО; 1 мг/кг) и их комбинированного действия на концентрацию провоспалительных цитокинов в крови мышей после моделирования сепсиса, пг/мл (М+m) Серии опытов ФНОα ИЛ1β ИЛ-6 4 24 4 24 4 24 Контрольная группа 1 23±3 (7) 25±4 (7) 14±3 (7) 18±4 (7) 26±5 (7) 20±4 (7) Сепсис (контрольная группа 2) 465±48a (7) 36±9 с (4) 385±39a (7) 85±23aс (4) 1590±180a (6) 143±37aс (4) Анабазин + сепсис (группа 3) 146±16ab (7) 20±4с (7) 174±18ab (7) 51±6aс (7) 205±25ab (6) 59±6abс (7) МАФНО + сепсис (группа 4) 310±30abd (6) 29±5с (7) 120±13abd (7) 35±4abсd (7) 143±16 abd (7) 40±5abсd (7) Анабазин + МАФНО + сепсис (группа 5) 100±12abde (7) 17±4 с (7) 84±9abde (7) 20±3 abсde (7) 87±9 abde (7) 32±4abсd (7) Примечание. 4 и 24 – время после моделирования сепсиса, ч; в скобках – число животных; a -p<0,05 по сравнению с контролем (группа 1); b -p<0,05 по сравнению с соответствующим параметром при сепсисе (контрольной группы 2); с -p<0,05 по сравнению с показателем через 4 ч; d - -p<0,05 по сравнению с показателем при воздействии анабазина; e -p<0,05 по сравнению с показателем при назначении МАФНО . Содержание ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 в крови мышей через 4 ч после моделирования сепсиса при применении МАФНО за 2 ч до введения взвеси E. coli (группа 4) уменьшалось по сравнению с параметрами при сепсисе (контрольная группа 2) соответственно в 1,50; 3,21 и 11,12 раза (p<0,05). Концентрация ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 в крови мышей через 4 ч после внутрибрюшинного введения взвеси E. coli при активации α7nAChR анабазином и введения мышам МАФНО (комбинированное действие препаратов) за 2 ч до моделирования сепсиса (группа 5) уменьшались по сравнению с показателями контрольной группы 2 соответственно в 4,65; 4,58 и 18,16 раза (p<0,05). Содержание ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 в крови статистически значимо (p<0,05) превышало показатели контрольной группы 1. Через 24 ч после моделирования сепсиса концентрация ФНО-α в крови мышей по сравнению с показателями контрольной группы 1 существенно не изменялась. При этом отмечались менее выраженные, но статистически значимые изменения (p<0,05) содержания ИЛ-1β и ИЛ-6, чем через 4 ч после введении E. coli, в группах 2, 3, 4, 5. Концентрация ФНО-α при экспериментальном перитоните с использованием комбинации анабазина и МАФНО снижалась максимально по сравнению изолированным эффектом препаратов, причем по сравнению с воздействием МАФНО эффекты анабазина и его комбинации с МАФНО были более выражены (соответственно в 2,12 и 3,10 раза, p<0,05). При этом эффект анабазина (уменьшение ФНО-α) превышал действие МАФНО (p<0,05) . Полученные данные свидетельствуют, что содержание в крови ИЛ-1β и ИЛ-6 при сепсисе и активации α7nAChR анабазином через 4 и 24 ч (группа 3) снижалось в меньшей степени (p<0,05), чем при использовании МАФНО (группа 4), а комбинированное действие анабазина и МАФНО (группа 5) вызывало уменьшение ПВЦ в крови большее, чем при их изолированном применении (p<0,05). Это позволяет заключить, что реализуется аддитивный эффект препаратов. Редукция концентраций в крови ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 при назначении анабазина связано с его активацией α7nAChR моноцитов, макрофагов, нейтрофилов (а также лимфоидных дендритных клеток) [6,9,15]. Снижение содержания ИЛ-1β и ИЛ-6 в крови при применении МАФНО, вызывающего нейтрализацию ФНО-α, обусловлено уменьшением их продукции, которая стимулируется данным цитокином (ФНОα) [5] . Таким образом, применение антител к ФНО-α и активация α7nAChR анабазином за 2 ч до моделирования сепсиса вызывают существенное снижение летальности мышей от экспериментального сепсиса (внутрибрюшинное введение взвеси микробных тел E. coli) вследствие уменьшения в крови концентрации провоспалительных цитокинов ФНО- α, ИЛ-1β, ИЛ-6. Комбинированное использование анабазина и МАФНО и приводило к их аддитивному эффекту.

ЛИТЕРАТУРА

1. Забродский П.Ф. // Фармакол. и токсикол. 1987. Т 49, №2. С. 57-60.

2. Забродский П.Ф. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1995. Т. 119, № 8. С. 164 - 167.

3. Забродский П.Ф., Лим В.Г., Шехтер М.С., Кузьмин А.В.// Бюл. эксперим. биол. и мед. 2012. Т. 153. № 5. С. 656 - 659.

4. Aikawa N., Takahashi T., Fujimi S. et al. // J. Infect. Chemother. 2013. Vol. 19, №5. P. 931-940.

5. Bradley JR. // J. Pathol. 2008. Vol. 214, №2. P.149-160.

6. Borovikova L.V., Ivanova S., Zhang M. et al. // Nature. 2000. Vol. 405, № 6785. P. 458- 462.

7. Martin G.S. // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2012. . Vol. 10. №6. Р. 701-706.

8. Newham P., Ross D., Ceuppens P. et al. // Inflamm . Res. 2014. Vol. 63, №2. P. 149- 160.

9. Oke S.L., Tracey K.J. // J. Leukoc. Biol. 2008. Vol. 83, №3. P. 512-517.

10. Pavlov V.A.// Int. J. Clin. Med. 2008. Vol. 1, №3. P. 203-212.

11. Pohanka M. // Int. J. Mol. Sci. 2012. Vol. 13, № 2. P. 2219-2238.